탄수화물, 당 및 글리코사이드 분석에 있어 고전적으로 사용된 검출 방법은 굴절률 검출(Refractive Index Detection) 입니다.

이들은 공통적인 분자 구조를 가지고 있어 분리에도 어려움이 있지만 기본적으로 분자 구조 내에 별다른 2, 3 중 결합에 의한 고리 구조 등의 존재하지 않아 200 ~ 800 nm 범위의 파장에서 흡광 및 형광 반응을 하지 않습니다.

따라서 분석물의 종류에 구애받지 않고 검출가능한 검출법을 써야하며 대표적으로 굴절률 검출기와 레이저 산란 검출 방법이 사용됩니다.하지만 굴절률 검출 및 레이저 산란 검출 방법은 많은 문제가 존재하며 이들은 사용자의 사용 경험에 지대한 영향을 줄 수 있습니다.

먼저 굴절률 검출기는 플로우셀을 지나는 이동상의 굴절률을 검출하는데, 굴절률의 경우 용액 내 용질의 농도에 직접적으로 영향받습니다. 이동상의 조성 역시 일종의 용매 변화와 동일하기 때문에 굴절률 검출기를 이용한 검출에서는 그래디언트 분리가 불가능합니다.

탄수화물, 당 및 글리코사이드는 모두 비슷한 구조를 가지고 있으며 결합 차수에 따라 종류가 결정되는 경우가 많습니다. 이는 물리, 화학적 성질이 비슷함을 의미하며 세밀한 분리를 위해선 그래디언트 분리가 필수적으로 요구됩니다. 

하지만 굴절률 검출기(RID)는 그래디언트 분리가 불가능하며 이에 따라 분리 제한이 발생합니다.

또한 굴절률 검출기의 경우 용액 내 몰 농도에 영향을 받기 때문에 분자량이 상대적으로 큰 당류에는 검출 감도가 급감합니다. 감도가 낮기 때문에 올리고당 및 다당류 분석에 있어 시료의 농도를 높여야 하는 경우가 많으며 당류의 특성상 농도가 높아질 경우 시료의 점도가 증가하는 경우가 자주 발생합니다. 높은 점도의 시료는 HPLC 전반적인 이동상 라인에 피로를 누적시키며 컬럼에 매우 치명적으로 작용할 수 있습니다.

또한 분리를 위해 보통 리간드 교환 방식을 사용하며 이동상으로 물을 사용하는 경우가 많습니다. 물 혹은 물에 소량의 유기 용매를 섞어 이동상으로 사용하며 이를 통한 분리 방법 역시 검출 감도가 급감하게 되고 컬럼에 쌓일 수 있는 흡착 오염 등 컬럼 오염을 방지하고 안정화를 위한 클리닝 프로그램을 별도로 사용자가 직접 사용해야 할 수 있으며 이는 컬럼의 수명을 단축시키는 주요 원인이 됩니다.

ALEXYS Analyzer 시스템과 DECADE Elite 검출기는 이러한 고전적 분석법의 여러 단점을 완벽하게 극복했습니다.

1. Separation                                                                             

리간드 교환 분리 방식이 아닌 고성능 음이온 교환 분리 방식(HPAEC; High Performance Anion Exchange Chromatography)을 사용합니다. 이를 통해 기존의 리간드 교환 혹은 C18-아미노기 교환 방식으로는 분리하기 어려웠던 분리를 달성할 수 있습니다.

또한 분석 대상 당류마다 컬럼을 다르게 써야하는 기존의 컬럼과는 다르게, Antec Scientific의 SweetSep™ AEX 20 혹은 AEX 200 컬럼으로로 보편적인 단당 및 이당류부터 다당류까지 분리 및 분석 가능합니다.

아래는 SweetSep™ AEX200 컬럼을 이용한 단당, 다당류 분석 예시 크로마토그래피입니다.

4~8 가지의 당을 집중적으로 분석하며 분석 종류 마다 컬럼 및 이동상을 교체하는 Silica- , polymer- based 리간드 교환 방식의 컬럼과 다르게, SweetSEP™ 컬럼은 많은 당을 한번에 분리할 수 있습니다.

이는 분리 방식이 음이온 교환 방식에 기반하기 때문인데, 음이온 교환 방식과 그래디언트 분리를 이용해 DP1 ~ DP90 당을 모두 분리할 수 있으며 DP1~DP2 내에서도 여러가지 개별 당을 분리할 수 있습니다.

Mono, Di- Saccharides 분석의 대표적인 예시는 꿀 내 당 분석(Sugar in Honey)입니다. 

시중의 silica 혹은 polymer에 기반한 리간드 교환 방식의 분리 컬럼과 그 분석법역시 꿀 내의 당 분석을 시연합니다. 하지만 이들은 매우 제한된 당류 분석을 할 수 있으며 0.2 ~ 2 %(약 1,000 ~ 20,000 ppm) 의 매우 높은 표준액 농도를 사용합니다.

표준액 분석의 경우 문제가 없지만 실제 분석할 시료에는 분석 대상 물질을 제외하고도 매우 많은 물질들이 존재합니다.
이러한 물질들의 존재는 곧 분석 대상 샘플의 간섭으로 이어지며 이는 분석 결과의 신뢰도 저하로 이어지게 됩니다.

다음은 SweetSep™ AEX200 컬럼을 이용한 실제 시판 꿀 샘플과 대표적인 단, 다당류 표준액 분석 크로마토그램입니다.

크로마토그램 비교에서 알수 있듯이, 매우 AEX 200 컬럼의 뛰어난 감도와 분리도를 통해 실제 샘플에서도 매트릭스 간섭을 최소화 하며 분석 대상 당류를 정확하게 분리해낼 수 있었습니다.

2. Precision, Accuracy, Linearity                                            

고전적인 당 분석법의 또다른 문제점은 분석 결과의 신뢰도입니다.

굴절률 검출 및 레이저 산란을 이용한 당 분석법은 정밀성(RSD), 정확성 및 직선성 등 HPLC 시스템의 적합도를 평가하는 대표적인 지표들이 만족스럽지 못한 경우 많습니다. 특히, Silica-based, Amino group에 기반한 분리 컬럼은 회수율과 직선성이 제대로 나오지 않아 분석 결과 자체를 사용하지 못하는 경우가 빈번합니다.

이러한 고전적 분석법의 단점들은 Antec Scientific의 DECADE Elite와  SweetSep™ 분리 컬럼으로 극복할 수 있습니다.

하기 표는 대표적인 단당, 이당류 당을 0.1 - 50 µM 농도 범위에서의 직선성 평가 자료입니다.

다음은 대표적인 단당 및 이당류 분석의 정밀성 평가 자료입니다.

고전적 당 분석법의 경우 컬럼, 검출, 매트릭스 간섭 등 여러가지 간섭 요인이 작용해  3 ~ 5 % 이상의 매우 불안정한 결과를 보였습니다.

하지만 Antec Scientific의 ALEXYS Analyzer를 통한 분석은 획일화된 분석 환경을 제공하며 그에 따라 매우 뛰어난 직선성 및 정밀성을 보였습니다.

3. Detection Limit                                                         

Antec Scientific의 DECADE Elite는 기존의 굴절률 검출 혹은 레이저 산란 검출이 아닌 전기 화학적인 검출 방법을 사용합니다.

염기성(pH > 12 ) 조건 하에서 음이온 형태로 존재하는 당 및 탄수화물 분자에는 산화-환원 반응을 일으킬 수 있습니다.
주기적인 전류 펄스를 줘 산화 환원 반응을 일으킴과 동시에 전극에서 분석물을 밀어 내 클리닝이 이뤄지는 방식을 채택합니다.

이러한 방식을 펄스 전류 검출법(Pulsed-Amperometric Detection)이라고 하는데, 산화-환원 반응을 이용하여 전기화학적 검출 방법은 매우 뛰어난 검출 감도를 자랑합니다.

하기 표는 SweetSep™ AEX 200 컬럼을 통한 당 분석의 LOD, LOQ 평가 자료입니다.

기존의 굴절률 검출 혹은 레이저 산란 검출의 경우 검출 한계가 ppm 수준으로 감도가 떨어지는 것에 비해 전기 화학 검출기인 DECADE Elite의 경우 8 ~ 70 nmol/ml(혹은 5.0 ~ 50) ppb 정도의 검출 한계(LOD; Limit of Detection)를 가지는데, 굴절률 혹은 레이저 산란 검출에 비해 약 100 배 이상의 검출 감도에 차이가 있습니다.

물을 기반으로한 이동상을 사용하는 굴절률 검출 환경의 경우 당 및 탄수화물 분자가 중성 상태로 존재하게 됩니다. 따라서 전기화학적 반응이 불가능함을 의미하며 중성 수용액의 특성상 분리 - 검출 과정 중에서 변성이 일어날 수 있습니다.

하지만 DECADE Elite와 SweetSep 분리 컬럼은 pH > 12 조건의 NaOH 기반 염기 용액을 이동상으로 사용하며 NaOAC를 첨가하여 분리를 조절합니다. NaOH에 기반한 분리 방법은 다양한 장점을 가집니다.

1. 강염기 조건 형성으로 모든 당 분자가 안정적인 음이온 형태로 존재 

2. NaOH에 기반한 이동상과 그래디언트 분리를 통해 시간별 용리력 조절

3. NaOAC를 첨가제로 사용해 부분적인 분리 개선 가능

4. 컬럼 클리닝이 매 분석마다 실시간으로 진행돼 컬럼 수명 연장

위와 같은 장점을 통해 ALEXYS Analyzer는 단당, 이당, 올리고당 및 다당류를 매우 정확하고 뛰어난 감도로 분석할 수 있습니다.

다음은 말토덱스트린 표준액을 통한 DP1 ~ DP30 당의 분리 크로마토그램과 프럭탄 분석을 통한 DP1 ~ DP90 분리 크로마토그램입니다.

DECADE Elite 검출기의 매우 뛰어난 감도와 SweetSep 컬럼의 강력한 분리는 여러분에게 매우 폭넓고 강력한 분석 범위를 제공합니다.

4. Summary                                                                 

DECADE Elite ECD 검출기와 SweetSep™ 음이온 분리 컬럼에 기반한 HPAEC-PAD 시스템 ALEXYS Analyzer는 탄수화물, 당 및 글리코사이드 분석에 있어 매우 강력하고 광범위한 분석을 제공합니다.

여러가지 제약이 존재하는 고전적 분리, 검출 방법에 비해 뛰어난 분리도 및 검출 감도를 통해 여러분에게 매우 만족스러운 사용 경험을 제공할 수 있습니다. 또한 획일화된 분석법을 통해 높은 완건성을 가지는 분석 시스템을 구성할 수 있으며 이를 통해 뛰어난 정밀성, 정확성을 제공합니다.

또한 부분적으로 RI, ELSD 및 MS 검출기를 번갈아가며 사용해야하는 고전적 분석법에 비해 전기 화학 검출기 하나를 통해 모든 분석을 수행할 수 있어 중복된 시스템 구성을 피할 수 있습니다.

이러한 개별적인 요소가 집합된 Antec Scientific의 ALEXYS Analyzer는 여러분에게 최상의 분석 경험을 제공합니다.