Sykam 자동 아미노산 분석기는 닌하이드린 반응액을 이용한 컬럼 후 유도체화 반응을 이용합니다.

Structure
 - Post Column Derivatization, Reagent Pump

 Sykam 자동 아미노산 분석기의 구조는 아래 모식도와 같습니다.

 Sykam 자동 아미노산 분석기는 컬럼 후 유도체화법을 쓰는데, 컬럼에서 분리된 아미노산과 일정하게 공급되는 유도체화 반응액이 섞여 반응로에서 유도체화 반응이 진행된 후 검출기에서 검출됩니다. 

이 분석법을 사용하기 위해선 분석 시간동안 일정하게 반응액을 공급하는 반응액 펌프와 반응 조건을 일정하게 유지하는 반응로가 필요합니다. 따라서 일반적인 HPLC 구조에서는 수행할 수 없는 분석 어플리케이션 중 하나입니다.

 컬럼 후 유도체화법(Post Column Derivatization)을 이용하는 Sykam 아미노산 분석기는 매우 우수한 정밀도 및 정확성을 제공합니다. 대표적으로 Ninhydrin Reagent를 이용합니다.

 OPA/FMOC 등을 이용한 컬럼 전 유도체화법(Pre Column Derivatization)은 일반적인 HPLC 장비에서 구조적인 변경 혹은 추가 없이 사용할 수 있다는 장점이 있지만 이 방법은 통제되지 않는 유도체화 조건 등에 의해 정밀성, 재현성 및 정확성 등에 문제가 발생한다는 단점이 있습니다.

 Sykam 아미노산 분석기는 분석 시간 동안 반응액을 일정하게 공급하는 반응액 펌프와 반응 조건을 일정하게 유지시켜주는 Reactor Oven을 통해 매우 일정한 반응 조건을 형성하며 이를 통해 매우 우수한 정밀성, 재현성 및 정확성을 확보할 수 있습니다.

Ninhydrin Reaction
 - Universial Reagent, Sensitive Detection

Ninhydrin Reagent는 매우 강력한 산화제로써 1, 2차 아민기(-NH₂)를 유리시키는 성질을 가지고 있습니다.

아미노산의 아민기 혹은 암모니아와 반응한 Ninhydrin은 결과물로 보라색 발색체를 형성합니다. 프롤린, 하이드록시프롤린의 경우 아미노기가 아닌 이미노기를 가지고 있기 때문에 보라색 발색체가 아닌 옅은 노란색 발색체가 형성됩니다.

 닌하이드린 유도체화 반응에는 다양한 장점이 있습니다.

 닌하이드린 유도체화 반응의 결과물에서, 아미노산의 종류를 결정하는 곁사슬이 존재하지 않습니다. 따라서 아미노산 별로 일정한 반응 결과물을 형성합니다. 이러한 방법은 아미노산 별로 매우 일정한 반응 수율을 얻을 수 있으며 이를 통해 다양한 아미노산을 동일한 방법으로 검출할 수 있습니다.

 따라서 570&440 nm 두 파장의 흡광도만 검출하면 모든 아미노산을 분석할 수 있습니다.
OPA 반응은 결과물로 아미노산의 곁사슬이 따라오게 되고, 이에 따라 각 아미노산 별로 최적화된 검출 파장이 달라지게 됩니다.

 또한 닌하이드린법은 컬럼 분리 후 유도체화를 진행하는 컬럼 후 유도체화법(Post-Column Derivatization)이기 때문에 매우 우수한 분석 정밀성, 재현성을 제공합니다. USP <1225>에서 제시하는 액체 크로마토그래피 장비의 적격성 평가 조건으로 머무름 시간 및 피크 면적의 RSD 값을 2 % 이하로 제한하는데, Sykam 자동 아미노산 분석기의 경우 1 % 이하의 우수한 정밀성을 제공할 수 있습니다.

 OPA/FMOC 등의 컬럼 전 유도체화법(Pre-Column Derivatization)을 사용하는 시스템의 경우 유도체화 반응이 사람의 손을 통해 진행되거나 시료 주입 장치에서 진행되는데, 이러한 유도체화는 일정한 반응 수율을 얻기 매우 어렵고 이는 곧 분석 결과의 재현성 문제가 발생할 수 있으며 이는 곧 적격성 평가 등 장비 평가 조건인 재현성 평가에 문제가 발생할 수 있음을 의미합니다.

Principle of Separation
 - Cation exchange, pH Gradient

 Sykam 아미노산 분러 킬럼은 기본적으로 양이온 교환을 이용해 아미노산을 분리합니다.
양이온 교환 방법을 통한 분리 방식은 매우 우수한 분리도와 선택성 그리고 컬럼 수명을 제공합니다.

일반적으로 HPLC 혹은 UHPLC 시스템에서 아미노산 분리 컬럼으로 사용되는 역상 컬럼의 경우 짧은 분석 시간을 가진다는 장점이 있습니다. 하지만 이 컬럼은 분리 가능한 아미노산의 종류가 제한되며 실제 시료 분석 등에서 발생하는 매트릭스 간섭에 매우 취약하다는 단점이 있습니다. 

 이에 반해 양이온 교환 방식을 이용하는 분리 컬럼은 높은 선택성에 기반해 매트릭스 간섭에서 자유롭습니다.
pH, 온도, 몰농도, 극성 등 다양한 분석적 파라미터를 통해 그래디언트를 적용할 수 있으며 이를 통해 뛰어난 분리도와 분리 확장성을 제공합니다.

pH 변화에 취약한 역상 컬럼에 반해 아온 교환 컬럼은 고분자에 기반해 매우 우수한 내화학성을 가지는데, 이를 통해 뛰어난 컬럼 수명을 제공할 수 있습니다.

Sykam 아미노산 분석기는 다음과 같은 장점을 가집니다.

1. 내화학성
   - Key Point: Chemical resistance, PEEK, Stainless Steel

 아미노산 분석에 사용되는 이동상은 pH 2 ~ 13의 산 및 염기를 모두 사용하며 반응액은 높은 부식성을 가집니다.
일반적으로 액체 크로마토그래피 시스템에서는 높은 압력에 대응하기 위해 스테인리스 스틸 재질을 사용합니다. 하지만 이러한 스테인리스 스틸 재질은 화학적 부식성이 높은 이동상과 반응액을 사용하는 아미노산 분석에 적합하지 않습니다. 이에 대응하기 위해 코팅 혹은 Passivation을 통한 산화막 형성을 제시하는데, 이러한 방법들은 일시적인 대응책일 뿐 근본적인 해결책이 되지 못합니다. 

 Sykam 자동 아미노산 분석기는 모든 유로에 PEEK, PTFE, FEP 등의 고분자 플라스틱을 사용하며 이를 통해 시스템 전반적으로 매우 뛰어난 내화학성을 제공합니다. PEEK 재질은 그 어떠한 금속 기반 재질보다 뛰어난 내화학성을 자랑합니다. 스테인리스 스틸 재질 기반의 아미노산 분석기는 짧게는 1년 단위로 유로 교체 혹은 펌프 소모품 교체 등의 주기적인 유지보수를 요구할 수 있습니다. 이에 반해 고분자 플라스틱에 기반한 Sykam 자동 아미노산 분석기는 최소 5년 이상 어떠한 유로 교체 없이도 사용 가능할 수있습니다. 

2. 내구도
   - Key Point: Low Pressure, Low Maintanance, 7 μm resin

 7 μm PS-DVB 고분자 레진에 기반한 Sykam LCA 양이온 교환 컬럼은 35 ~ 50 bar의 매우 낮은 컬럼 압력을 가집니다. 낮은 압력과 이온 교환 방식에 기반한 컬럼은 적합한 시료 전처리 조건 하에 매우 뛰어난 컬럼 내구도와 긴 수명을 제공합니다.

 시중의 다양한 HPLC 제조사가 제시하는 아미노산 분석 어플리케이션은 대부분 C18-Silica 기반의 컬럼을 사용합니다. 분리가 어려운 아미노산의 특성상 보다 작은 Silica 고정상과 긴 컬럼 길이를 사용하며 이는 곧 매우 높은 시스템 압력을 의미합니다. 150 bar의 기본 압력에서 최근에는 350 bar 이상의 매우 높은 압력에 기반한 컬럼을 제시합니다.

 크로마토그래피 시스템에서 가장 기본적인 명제 중 하나는, 시스템에 가해지는 압력은 높으면 높을수록 높은 물리적 스트레스를 준다는 것입니다. 시스템을 구성하는 분석 장비와 컬럼 양측에 매우 큰 물리적 스트레스로 작용하게 됩니다. 이는 곧 짧은 점검 주기와 잦은 소모품 교체로 이어집니다.

 Sykam 아미노산 분석기 시스템은 고분자 플라스틱에 기반한 장비로써 매우 낮은 압력으로 설계된 분리 컬럼을 사용해 시스템에 가해지는 스트레스가 최소화된 시스템입니다. 이를 통해 장비 점검과 가동 중단을 최소화하여 끊김 없는 워크 플로우 환경을 제공합니다.

 예를 들어 대표적인 펌프 소모품에는 플런저 씰이 있습니다. 이는 펌프 피스톤에 압력을 잡아주는 역할을 하는 핵심 소모품입니다. 대부분의 HPLC 및 UHPLC 제조사는 최소 6개월마다 플런저 씰의 교체를 요구합니다. 이에 반해 Sykam 아미노산 분석기의 경우 펌프에서 Leak가 관찰되지 않는 이상 어떠한 유지보수도 하지 않습니다. 짧게는 1년, 길게는 3년 이상 펌프 헤드의 분해 없이 사용합니다.

3. 높은 분리 도
   - Key Point: High Resolution, Good Column, Gradient

 Sykam 아미노산 분리 컬럼 LCA 시리즈는 매우 우수한 분리도와 큰 컬럼 용량(Capacity)를 자랑합니다. 30 - 210  mm의 다양한 길이의 컬럼을 제공하며 각 컬럼에 최적화된 분석법을 제공해 분석 시스템을 여러분의 요구에 맞게 최적화합니다.

 아미노산의 분리는 컬럼 뿐만 아니라 적합한 구연산 완충 용액 그리고 이를 통한 그래디언트가 복합적으로 작용합니다. 따라서 아미노산 분리 컬럼의 성능 평가는 일반적으로 100 % A 등용매 조건에서 분리되는 Threonine/Serine의 분리도를 평가합니다. 타사 아미노산 분리 컬럼의 경우 THR/SER의 분리도로 최소 1.2를 제시하지만 Sykam LCA 아미노산 분리 컬럼은 최소 1.4를 보장합니다.
Na+ 이온에 기반한 구성 아미노산 분석 시스템에서는 최소 1.4, Li+ 이온에 기반한 유리 아미노산 분석 시스템에선 최소 1.7을 보장합니다. 

 아미노산 분석에서는 일반적으로 정해진 종류의 아미노산만 분리하는 경우가 많기에 높은 분리도가 필요하지 않다고도 합니다. 하지만 양이온 교환에 기반한 분석 특성상 실제 분석할 시료 내에는 매트릭스 간섭이라고 하는 매우 다양한 간섭원이 존재합니다. 이러한 간섭원의 존재는 분석 결과를 왜곡하고 방해하게 됩니다.

 또한 유럽 약전의 아미노산 분석법에서는 약 600 ppm 농도의 매우 높은 농도의 표준액 주입을 요구합니다. 높은 농도의 시료 주입은 곧 컬럼의 용량(Capacity)에 영향을 줄 수 있는데, 길이가 짧은 컬럼은 이러한 분석에 있어 용량 확보에 어려움이 있을 수 있습니다. 이는 Lysine, Hsitidine 등 암모니아와 비슷한 시간대에 용리되는 물질 분석에서 암모니아 피크가 분리되지 않거나 검출되지 않는 문제가 발생할 수 있습니다.

 Sykam 자동 아미노산 분석기는 분석 장비, 컬럼, 이동상, 분석법을 복합적으로 최적화해 우수한 분리도와 높은 선택성 그리고 큰 컬럼 용량을 가집니다. 이러한 특성은 실제 시료 등에서 발생하는 매트릭스 효과에도 비교적 높은 분리도를 제공해 분석 결과의 신뢰도를 높입니다.

다음은 Sykam LCA K13/Na 컬럼을 통한 20종 구성 아미노산 표준품 크로마토그램과 분리도 평가표입니다.
주입 주기는 65분이며, 내부 표준품으로 사용되는 노르루신(NLE; Norleucine)을 제외한 모든 피크의 분리도가 1.5 이상입니다.

4. 소모품
   - Key Point: Made In Korea, Delivery

 pH에 기반한 분리를 수행하는 아미노산 분석에는 기본적으로 구연산 완충 용액(Citrate Buffer Solution)이 이동상으로 사용됩니다. 사용하는 시스템의 종류에 따라 소듐, 리튬, 포타슘에 기반한 구연산 완충 용액을 사용하며 반응액으로는 닌하이드린 반응액을 사용합니다. 물론, 이러한 이동상들은 사용자가 직접 제조하여 사용할 수 있지만 제조 방법과 품질 관리가 매우 까다롭습니다. 따라서 대부분의 사용자는 이동상과 반응액을 구매하여 사용합니다.

 타사의 경우 장비 제조사와 이동상 제조사가 다른 경우가 많습니다. 또한 국내 장비 공급사와 이동상 공급사가 다른 경우도 존재합니다. 국내에서도 지역별로 공급처가 다를 수 있는 점, 소량 발주에 기반하기에 오래 걸리는 점, 복잡한 유통 구조에 의한 높은 가격은 여러분의 분석 환경을 유지하는데 매우 큰 단점으로 작용할 수 있습니다.

 (주)아주과학은 아미노산 분석에 사용되는 모든 이동상 및 반응액을 국내에서 직접 생산합니다. 해외에서 원료와 제조 기술을 이전해 한국에서 제조하며 이를 통해 매우 합리적인 공급 가격과 빠른 배송을 제공합니다. 이는 아미노산 분석 시스템을 사용함에 있어 장기적으로 매우 중요한 요소 중 하나입니다. 타사 대비 최소 40% 이상 저렴한 가격과 당일 주문 익일 배송 시스템은 많은 사용자로 하여금 (주)아주과학을 선택해 주신 이유 중 하나입니다.

5. 컬럼
   - Key Point: Resin Size, Column Lifetime, pH Gradient

 이론적으로 짧은 컬럼은 짧은 분석 시간을 제공하지만 분리도가 감소합니다. 분리도 향상을 위해 보다 작은 고정상을 사용하여 분리도를 향상시켜 짧은 분석 시간과 높은 분리도를 유지할 수 있습니다. 하지만 pH 그래디언트를 이용하는 아미노산 분석 시스템에선 이러한 이론을 적용하기 어렵습니다. 짧은 컬럼에 작은 고정상 크기는 다음과 같은 문제가 있을 수 있습니다.

1. 높은 컬럼 가격
 - 아미노산 분리 컬럼은 양이온 교환 레진을 사용합니다. 이온 교환 레진는 대표적으로 매우 비싼 고정상 중 하나인데, 이는 레진의 크기가 작으면 작을 수록 가격 역시 상승합니다. 이는 컬럼 가격 상승의 결정적인 요인이 되며 이러한 가격 상승은 여러분이 시스템을 유지함에 있어 큰 문제로 작용합니다.

2. 높은 컬럼 압력
- 같은 조건에서 레진의 크기가 작을수록 컬럼에 걸리는 압력은 상승합니다. 압력에 큰 저항성을 가지는 실리카 고정상과는 다르게 이온 교환 레진 고정상은 압력에 큰 저항성을 가지지 못합니다. 따라서 컬럼의 설계부터 작은 압력을 기반으로 설계되는데, 작은 고정상 크기는 곧 높은 컬럼 압력 문제로 작용합니다. 이를 해결하기 위해 컬럼의 길이를 더 짧게 하거나, 이동상의 점도를 조절해 압력을 낮추게 됩니다. 이온 교환 컬럼 수명 관리에 있어 핵심 포인트 중 하나는 당연히 컬럼 압력입니다. 높은 컬럼 압력은 상대적으로 짧은 컬럼 수명을 의미합니다.

3. 향상되지 않는 분리도 문제
 - 아미노산 분리 컬럼의 성능 평가는 일반적으로 100 % A 조건 하에서 분리되는 아미노산들, 예를 들어 Aspartic Acid, Threonine, Serine의 분리도를 평가합니다. 이중 Threonine과 Serine의 분리도 확보가 어려워 Serine의 분리도를 컬럼의 성능 평가 지표로써 활용하게 됩니다. 타사 아미노산 분리 컬럼의 경우 Serine의 분리도가 1.2-1.3 수준인 것에 비해 Sykam 아미노산 분리 컬럼 LCA K06 혹은 K13은 각각 Serine의 분리도로 최소 1.4 - 1.5를 제공합니다.

4. 암모니아 분리의 어려움
 - 아미노산 컬럼 성능에 크게 좌우되는 초반 피크들과는 다르게, 후반부에 분리되는 피크들은 대부분 컬럼의 성능보단 이동상과 그래디언트 조합에 크게 영향 받습니다. 대표적으로 Histidine, Lysine, Ammonia, Arginine이 있는데, 이들은 염기성 아미노산으로써 컬럼과의 상호작용이 너무 강해 일반적인 양이온 교환 방법으로는 분리하기 매우 어려워집니다. 이를 해결하기 위해 pH를 조절해 음이온화 시켜 강제로 컬럼에서 분리하는 방법을 사용합니다.

문제는, 컬럼의 길이가 짧은 경우 각 피크가 용리되기 전에 다음 물질이 용리되는 현상에서 나타납니다. 이러한 현상이 문제가 되는 것은 유럽 약전(EP) 2.2.56 아미노산 분석에 따른 개별 아미노산의 순도 분석에서 두각됩니다. 이 분석법은 약 600 ppm의 매우 높은 농도의 검체 주입을 요구합니다. 매우 높은 농도는 곧 매우 큰 피크를 의미하며 타사의 경우 이 분리에서 암모니아가 검출되지 않거나 분리되지 않아 어려움을 겪는 경우가 있습니다.

5. 시료 주입 시간
 - 짧은 컬럼을 이용하면 매우 짧은 분석 시간을 얻을 수 있고 이를 통해 분석의 효율을 극대화 할 수 있다고 합니다. 일반적인 HPLC 시스템이라면 당연히 맞는 말이지만, 아미노산 분석은 그렇지 않습니다.
아미노산 분석은 낮은 pH에서 시작해 높은 pH로 마무리되는 pH 그래디언트에 기반한 분리를 이용합니다. 즉, 분석 처음과 끝에서 컬럼의 pH는 큰 차이가 있는데 이를 다시 처음 상태의 pH로 안정화하는 과정이 필수적으로 요구됩니다. 이러한 안정화 과정은 짧은 컬럼이라고 하여도 최소 20분 이상이 요구됩니다.
피크를 얻고 분석이 끝나는 시간은 짧을 수 있어도, 다음 샘플이 주입되는 실제 분석 주기는 여전히 약 60분 가량입니다.

 Sykam Amino Acid Analyzer S 633은 대부분의 S 433 자동 아미노산 분석기 기반의 분석법을 그대로 계승할 수 있습니다. 따라서 Sykam S 433과 동일하게 구성 아미노산 및 유리 아미노산 분석을 뛰어난 성능으로 수행합니다.

 아미노산 분석 어플리케이션 종류는 양이온 크로마토그래피에서 분리 이온의 종류에 의해 결정되는데
구성 아미노산의 경우 Na⁺, 유리 아미노산의 경우 Li⁺, 생체 아민의 경우 K⁺를 교환 이온으로 사용하게 됩니다.
따라서 이동상, 컬럼의 종류가 각 이온에 따라 결정됩니다.

구성 아미노산 분석은 분석 대상 아미노산의 종류가 20종 이하기 때문에 빠른 분리와 안정적인 베이스라인을 보이는 Na⁺에 기반한 분리 시스템을 사용하며 반대로 유리 아미노산 분석의 경우 분석 대상 아미노산의 종류가 최대 60종 이상으로 늘어나기 때문에 세밀한 분리가 요구됩니다. 따라서 이온의 크기가 더 작아 더 많은 작용기로 작용할 수 있는 Li⁺이온을 사용합니다.
생체 아민의 경우 고정상과 매우 강한 상호작용을 하기 때문에 리튬, 소듐보다 더 분리력이 약한 포타슘을 이용합니다.

 대표적인 분석 어플리케이션은 다음과 같습니다.

1. 샘플 타입

• 가수분해 단백질
• 혈청 및 소변
• 생체 아민

2. 어플리케이션

• 선천성 대사 장애
• 사료
• 식료품
• 제약 품질 보증
• 의약품 적합성(약전)